Curso: RCB0300 – Tópicos em Biotecnologia III - 2022 | e-Disciplinas

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    Essa é a 6ª edição da disciplina de Tópicos em Biotecnologia III - Genética - com carga horária de 60 h e com o retorno das aulas presenciais a disciplina será oferecida utilizando as duas modalidades: virtual e presencial. O módulo I será virtual por meio da plataforma google meeting. As provas e o módulo II serão presenciais. Outras inovações na disciplina foram: 1) o acréscimo de 4 aulas práticas no módulo I envolvendo as diferentes etapas para análises in silico de transcriptomas e 2) mudança das aulas práticas do módulo II.

    Convém ainda ressaltar, excepcionalmente esse ano, a disciplina tem início tardio, praticamente na terceira semana de março e será oferecida no formato condensado com uma duração de 6 semanas. Terá inicio dia 21 de Março e término dia 4 de Maio. Para tanto, nas três primeiras semanas as aulas serão três vezes por semana: às segundas, quartas e sextas-feiras das 8:00 as 12:00 h e nas três últimas semanas as aulas serão duas vezes por semana: às segundas e quartas-feiras das 8:00 as 12:00 h. Isso irá exigir muita dedicação e compromisso de cada estudante durante esse período para melhor proveito de todo o conteúdo que a disciplina: Tópicos em Biotecnologia - Genética proporciona.

    A disciplina é organizada em 2 módulos contendo aulas teóricas, práticas e seminários tendo como objetivo introduzir as metodologias das análises de transcriptomas e uma visão das técnicas genômicas aplicadas a saúde humana (Módulo I) e conceitos sobre vacina de mRNA para COVID-19 visando a compreensão das pesquisas nessa área (Módulo II).

    Lembramos ainda que mesmo que o módulo I seja virtual é importante a presença de todos os alunos, uma vez que podem ocorrer situações em que não será possível realizar a gravação da respectiva aula, problemas inerentes das plataformas virtuais.

    Utilizaremos dois ambientes virtuais distintos.

    Ambiente 1: Sala para Aula Teórica - para o primeiro dia e todas as aulas teóricas ao longo do curso (na aba Programa e Apresentação).

    Ambiente 2: Sala para Seminários - será o mesmo para todas as apresentações de seminários (na aba Seminários).

    Contaremos com o auxílio do Bioinformata: Dr. Pablo Sanches que irá orientar os trabalhos de análise de transcriptomas.

    Contaremos ainda com o auxilio de dois alunos PAE: Marcos Lopes e Mariane Tirapelle.

    Bom curso a todos!

    Aparecida M. Fontes ( aparecidamfontes@usp.br ) 

    Nilce M. Martinez rossi ( nmmrossi@usp.br )

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    Outra inovação na disciplina diz respeito aos seminários. Foram selecionados artigos científicos que darão embasamento teórico sobre os dois grupos gênicos que serão investigados nas análises de transcriptoma: fatores de transcrição e genes de reparo de DNA.

    A nota do Seminário de cada aluno levará em conta o preparo, apresentação e discussão de seu próprio Seminário, bem como o aprendizado dos alunos que o assistem.

    Após cada seminário TODOS os alunos responderão questões relacionadas ao seminário assistido.

    Textos para Seminários:

    1***. Transcriptome-wide survey of gene expression changes and alternative splicing in Trichophyton rubrum                            

    2***. Transcription factors in fungi: Tfome dynamics, Three major families and dual specificity TFs 

    3. A label-free impedance biosensing assay based on CRISPR/Cas12a collateral activity for bacterial DNA detection 

    4. Exosomal RNAs: Novel Potential Biomarkers for Diseases—A Review  

    5***. Homologous recombination DNA repair deficiency and PARP inhibition activity in breast cancer

    6. Propolis and its potential against SARS-CoV-2 infection mechanisms and COVID-19 disease

    7. Computational identification of host genomic biomarkers highlighting their functions, pathways and regulators that influence SARS‑CoV‑2 infections and drug repurposing

    8. Nucleic Acid Testing of SARS-CoV-2

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    Data: 21 de Março (9:00-10:45)

    Professora: Nilce Maria Martinez Rossi

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de compreender:

    • Revisão do controle da expressão gênica em procariotos e eucariotos
    • Conceito de fatores de transcrição
    • Tecnologias de sequenciamento 
    • Relevância da Genômica para compreensão da variabilidade genética na resposta a drogas.
    • A atuação de genes que codificam fatores de transcrição na resposta a drogas.
    • Mecanismos moleculares de resistência a antifúngicos

    Questões relevantes:
    O que é a tecnologia do RNA-seq?
    Organismos modelo de estudo para entender a tecnologia do RNA-seq.
    Quais serão as perguntas biológicas que deverão ser respondidas com o uso do RNA-seq?

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    Data: 23 de Março (8:00-10:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Conhecer os passos para análise dos RNAs-seq;
    • Conhecer os programas disponíveis para análises online dos mesmos.


    Principais tópicos abordados:

    • Tipos de sequenciamento (single-end e paired-end)
    • Pipeline do RNA-seq
    • Análise da qualidade do sequenciamento
    • Processo de trimagem das reads
    • Alinhamento das reads
    • Expressão diferencial 
    • Enriquecimento funcional (identificar classes de genes que estão super-representadas em um grande conjunto de genes)
    • Principais softwares utilizados

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    Data: 23 de Março (10:10-12:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Conhecer a linhagem de dermatófito utilizado - Trichophyton rubrum CBS 118892, condições de cultivo com e sem UDA (0, 3, 12h), extração de RNA, sequenciamento.
    • Criação de conta no software online Galaxy (tutorial anexado abaixo).
    • Conhecer os bancos de dados que serão usados           
    • Instalar os programas que serão utilizados;
    • Definir o número de amostras em cada biblioteca;
    • Conhecer os principais comandos para buscar informações sobre as características das sequências depositadas


    Etapa 1: Análise da qualidade do sequenciamento

    1. FASTQC – 1ª rodada (análise de qualidade “pré-trimagem”) 

    2. Trimmomatic (“trimagem” de adaptadores e regiões de má qualidade) 

    3. FASTQC – 2ª rodada (análise de qualidade “pós-trimagem”) 

    4. Comparação dos resultados obtidos nas 1ª e 2ª rodadas 5. Desenvolvimento da tabela de resultados


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    Data: 25 de Março (8:00 - 10:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Demonstrar os relatórios de qualidade do sequenciamento; 
    • Aplicar algoritmos para filtro e remoção de adaptadores; 
    • Criar uma tabela contendo a identificação das amostras, a quantidade de reads (leituras) antes e após aplicação do processo.

    Etapas para análise da qualidade do sequenciamento:
    • Dados brutos no formato fastq.
    • Pré-trimagem: identificar contaminantes e análise do relatório de qualidade gerado
    • Trimmomatic: Retirar regiões similares as sequências de adaptadores;  retirar regiões com escore mínimo de qualidade e eliminar reads de tamanho mínimo
    • FASTQC: Comparar a qualidade do sequenciamento após processo de trimagem.

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    Data: 25 de Março (10:10 - 12:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Aplicar algoritmos para indexação do genoma de referência e mapeamento das reads (leituras) contra o genoma de referência; 
    • Ao final, criar uma tabela contendo a quantidade e o percentual de reads mapeadas por amostra.


    Roteiro da análise:
    • Enviar arquivos do genoma para o Galaxy
    • RNA STAR (mapeamento das bibliotecas de leituras contra o genoma de referência)
    • Finalizar a tabela de resultados sobre as características gerais das bibliotecas sequenciadas

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    Data: 28 de Março (8:00 - 9:00)

    Professores: Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Compreender a atuação dos genes de reparo na resposta a drogas.


    Conceitos abordados:

    • Tipos de lesão do DNA e sistemas de reparo (sistemas de reparo acionados de acordo com a lesão do DNA)
    • Sistemas de reparo do DNA e ciclo celular
    • Potencializadores da resposta às drogas anti-tumorais
    • Relação entre as infecções fúngicas e os genes de reparo



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    Data: 28 de Março (9:00 - 10:00)

    Professores: Aparecida M. Fontes e Thiago DePintor

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Compreender o uso do Blast para a busca de genes ortólogos

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    Data: 28 de Março (10:10 - 12:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Aplicar algoritmos para indexação do genoma de referência e mapeamento das reads (leituras) contra o genoma de referência; 
    • Ao final, criar uma tabela contendo a quantidade e o percentual de reads mapeadas por amostra.

    Conceitos abordados:
    • Contagem das leituras mapeadas no genoma de referência
    • Renomear arquivos mapped.bam no Galaxy (saída do software RNA STAR)
    • StringTie (quantificação da transcrição) 
    • Obter arquivo de contagem das leituras mapeadas por Gene

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    Data: 30 de Março (8:00 - 10:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Manipular algoritmos de contagem de reads (leituras) mapeados em cada gene.


    Conceitos abordados:

    • Normalização: como os genes se expressam diferencialmente em diferentes condições
    • Normalização RNA-seq: comprimento das diferentes moléculas de RNAs; profundidade do sequenciamento de diferentes bibliotecas e composição de RNA
    • Renomear arquivos Gene counts no Galaxy
    • DESeq2 (normalização e calculo da expressão diferencial) --> tratamento vs. controle
    • Obtenção dos resultados: 
    • PCA
    • Distância entre amostras
    • Dispersão
    • Histograma de p valor
    • Genes significativamente DE
    • Tabelas de genes significativamente DE

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    Data: 30 de Março (10:10 - 12:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Conhecer e aplicar métodos de normalização dos dados de expressão gênica.


    Conceitos abordados e roteiro:
    • Fazer o download dos relatórios DESeq2
    • Abrir arquivos no Excel 
    • Aplicar filtros (padj e log2fc) 
    • Classificar lista de genes

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    Data: 1 de abril (8:00 - 10:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Comparar as condições/amostras por meio da construção de gráficos de Análise do Componente Principal (PCA) e distância entre amostras.


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    Data: 4 de abril (8:00 - 10:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Utilizar algoritmos para identificação dos genes diferencialmente expressos; 
    • Conhecer as análises de expressão gênica global utilizando diagrama de Venn: https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/
    • Conhecer a busca de informações no banco de dados Gene Ontology: http://geneontology.org/
    • Compreender os passos para a análise de genes diferencialmente expressos utilizando o banco FungiFun e a classificação GO: https://sbi.hki-jena.de/fungifun/fungifun.php


    Questões: exemplo:

    • Em uma análise inicial sobre o panorama geral, há diferença na quantidade de genes diferencialmente expressos por categoria do GO quando comparado os dois tempos (2 e 12 hs)? Quais as similaridades? Quais as diferenças?
    • Há diferença na análise do panorama geral conforme o tipo de classificador utilizado: GO ou FunCat? Quais as diferenças e similaridades observadas nos tempos de 3 e 12 horas utilizando esses dois classificadores?

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    Data: 4 de abril (10:10 - 12:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Estabelecer os critérios para a avaliação de genes diferencialmente expressos. Nesse estudo: log de fold change: vermelho = induzido e verde = reprimido. Na tabela do valor de p ajustado: laranja significa que é p < 0.05. Para garantir a análise de um número maior de genes considerar o valor de p mais relevante do que o corte do valor de fold change.
    • Reconhecer como avaliar se a diferença do nível de expressão é estatisticamente significante.
    • Revisão sobre como encontrar o gene ortologo de Homo sapiens no BLAST - NCBI em Trichophyton rubrum (CBS) 118892 (linhagem do atual estudo).*
    • * alterar o programa de seleção ao final do Blast
    • Compreender os parâmetros do Blast: E value (quanto mais próximo de zero, mais confiável é a similaridade) e % identidade. Ex. 3x10E93 x 0,048. A primeira situação é confiável, mas a segunda não é confiável.
    • Criar heatmaps e tabelas com os resultados da análise de expressão gênica diferencial.


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    Data: 6 de abril (8:00 - 10:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Examinar os genes de interesse associados com fatores de transcrição e genes de reparo.

    Tópicos abordados:
    • Importância do cuidado sobre o estabelecimento do desenho experimental
    • Importância da realização do experimento em triplicata
    • Avaliação das similaridades entre as amostras por meio de gráficos da análise de componentes principais
    • Selecionar alguns genes diferencialmente expressos e validar por RT-PCR em tempo real
    • Revisão sobre os dois tipos de biblioteca de segunda geração: single-ended versus paired-end. No primeiro caso apenas uma das extremidades do fragmento de DNA é sequenciada e no segundo caso ambas as extremidades do fragmento de DNA são sequenciadas.
    • Revisão dos passos de análise dos dados de RNAseq utilizando a plataforma Galaxy
    • Uso do site: http://www.heatmapper.ca/expression/ para construção do heatmap.
    • Uso do site: https://www.ebi.ac.uk/interpro/ para análise de domínios proteicos.
    • Uso do site : https://string-db.org/ para análise de interação entre proteínas. Ele permite realizar a busca em Tricophyton.
    • Uso do site: https://www.genenames.org/ para encontrar a sigla oficial de determinado gene em humanos.
    • Uso do site: https://pfam.xfam.org/ para análise de famílias de proteínas por meio de cadeia de Markov escondida. Realiza o alinhamento de sequência de proteínas associadas. É uma análise mais aprofundada de análise de similaridade quando comparada com o blast, pois não avalia somente a sequência, mas também a similaridade em relação a estrutura de determinado domínio.

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    Data: 6 de abril (10:10 - 12:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Examinar os genes de interesse associados com fatores de transcrição e genes de reparo.

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    Data: 8 de abril (8:00 - 10:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Apresentação clara e objetiva dos resultados obtidos e contextualizando com os dados da literatura.

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    Data: 8 de abril (10:10 - 12:00)

    Professores: Pablo R. Sanches, Nilce M. Rossi e Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Apresentação clara e objetiva dos resultados obtidos e contextualizando com os dados da literatura

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    Data: 18 de abril (8:00 - 10:00)

    Professores: Wilson Araujo Silva Jr.

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Serão apresentados o projeto mencionado e os resultados obtidos até o momento.


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    Data: 18 de abril (10:15 - 12:00)

    Professores: Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Compreender os diferentes tipos de vacina para prevenção da infeção por SARS-CoV-2 com foco diferencial em vacinas de mRNA


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    Data: 25 de abril (8:00 - 10:00)

    Professores: Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Análises in silico em três sites com bancos genômicos


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    Data: 2 de maio (10:00 - 12:00)

    Professores: Aparecida M. Fontes

    Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:

    • Compreender as principais análises de dinâmica molecular e docking para definição de epítopos para o desenvolvimento de uma vacina viral


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