Programação
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Link do Google Meet para todas as aulas da disciplina.
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Vídeo que deve ser visto na segunda parte da 1a Aula da disciplina de Esmalte Dentário.
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Resuma em algumas frases o que aprendeu na aula de hoje.
A atribuição de presença depende do envio deste resumo, uma vez que a USP precisa do registro de frequência nas disciplinas. Como nossa disciplina terá aulas assíncronas, é indispensável que, a cada aula, o aluno complete o resumo.
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Aula 2 - 18/08/2023 - Métodos para tecidos mineralizados
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Na 1 parte da aula a Profa. Dra. Raquel F. Gerlach apresentou alguns métodos muito usados para estudar tecidos mineralizados e mostrou o uso destes métodos em um trabalho científico que investiga o grau de mineralização e a composição mineral de fósseis (o trabalho está disponível no material adicional desta aula para leitura por quem quiser saber mais).
Na apresentação se discutiu inicialmente a necessidade de preparar cortes e desgastá-los até a espessura de pelo menos 200 um (0,2 mm), sendo ideal a espessura de 100 um. Estes cortes podem ser usados para olhar diretamente no microscópio de luz (com a luz atravessando o corte!), além de serem usados para microrradiografia (atualmente esta pode ser substituída por microCT), além de microscopia de luz polarizada e microscopia eletrônica de varredura (MEV), onde frequentemente se usam detectores de metais para estudar os tecidos mineralizados, como o EDS e o EDX.
Nos cortes de dentes ou de fósseis de dentes preparados por destaste, todos os tecidos mineralizados podem ser estudados, inclusive o esmalte dentário. Para estudos bem mais detalhados de microelementos de dentes, a microfluorescência de raios X produzida com energias muito altas pode ser usada para produzir mapeamentos com sensibilidade muito maior. Um exemplo de possibilidade para fazer este mapeamento sem perda da informação anatômica da distribuição de elementos é o uso da luz Síncrotron para gerar a fluorescência, e por isso citamos o novo acelerador de partículas, o Sirius, localizado em Campinas, SP:
https://cnpem.br/en/sirius-o-que-e-e-como-funciona-o-acelerador-de-particulas-brasileiro/
Excetuando-se o o esmalte dentário, os outros tecidos mineralizados dos vertebrados podem ser descalcificados, pois são "ricos" em matéria orgânica. Ao se descalcificar um espécime, ele pode ser cortado como se fosse um tecido mole (porque na verdade ele se "torna um tecido mole" pela ação do agente descalcificador (que pode ser um ácido ou o EDTA). E assim, lâminas finas podem ser feitas (de 0,005 mm, ou 5 um), e desta forma se estuda costumeiramente a estrutura orgânica do osso, da dentina e do cemento, tecidos em que o componente orgânico consitui mais da metade do volume dos tecidos. Os cortes descalcificados não serão objeto da nossa aula de hoje, pois são frequentemente usados em Atlas de Histologia, e podem ser facilmente consultados.
Houve um intervalo de 5 minutos antes da 2a parte da aula, também gravada.
Na segunda parte da aula o Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira nos apresentou imagens extraordinárias de tecidos mineralizados com matriz orgânica (principalmente tecido ósseo maduro e tecido ósseo formado em culturas de osteoblastos in vitro) em cortes calcificados FINOS. Isso mesmo !!! Várias destas imagens apresentavam a matriz do tecido ósseo QUE NÃO HAVIA SIDO DESCALCIFICADA, e mesmo assim os cortes eram finos (~5 um) e corados pelos corantes histológicos convencionais, como o vermelho de alizarina. Esses cortes são obtidos por uma técnica bastante específica para cortes de tecidos mineralizados e de implantes dentários de titânio, também mostrados pelo Prof. Paulo nesta aula. Nesta técnica, os espécimes são embebidos em resina acrílica de forma bastante lenta (é uma resina muito cara) e o bloco fica bem duro, a ponto de poder ser colado a uma lâmina de resina e desgastado por uma máquina lixadeira até a espessura de 5 um. Os excelentes resultados deste método de preparação de tecidos mineralizados foram mostrados nesta aula, onde os detalhes do citoplasma (aparelho de Golgi) e do núcleo dos osteócitos foram apontados pelo Prof. Paulo e a resolução era evidentemente superior a um corpo descalcificado e incluído em parafina, como os que ainda hoje usamos nas aulas práticas da Graduação da FORP e certamente outros centros também usam.
Vimos imagens maravilhosas que colaboraram muito no estudo do tecido ósseo e colaboram bastante para nossa compreensão do papel das moléculas protéicas na mineralização do tecido. Também será disponibilizado um artigo sobre o assunto da segunda parte da aula.
Agradeço a todos a atenção e o interesse.
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Resuma em algumas frases o que aprendeu na aula de hoje.
A atribuição de presença depende do envio deste resumo, uma vez que a USP precisa do registro de frequência nas disciplinas. Como nossa disciplina terá aulas assíncronas, é indispensável que, a cada aula, o aluno complete o resumo.
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Aula gravada com os alunos com visão rápida sobre os tecidos mineralizados que têm colágeno tipo 1 como sua principal matéria orgânica, que são: osso, dentina e cemento.
Discussão sobre como se estudam estes 3 tecidos normalmente: descalcificação e histologia convencional para ver a parte orgânica.
Descrição da matriz óssea não mineralizada secretada por osteoblastos. Essa matriz se chama osteóide e vimos um artigo que discute as técnicas de coloração para identificar esta matriz recém-secretada pelos osteoblastos. O osteóide tem coloração mais fraca do que a matriz óssea calcificada, e pode ser sempre reconhecido junto aos osteoblastos, que formam um alinha de células com características de células com intensa atividade de síntese protéica.
A seguir falei bem pouco sobre a formação da dentina, que em quase tudo se assemelha ao osso, exceto na forma. A dentina apresenta os túbulos dentinários, bastante característicos da dentina. A matriz não mineralizada, na dentina, se chama pré-dentina.
Houve uma pergunta sobre dentina reparadora e sobre sensibilidade dentinária.
Agradeço a atenção.
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Hoje não teremos aula gravada e nem online.
Por favor leiam o artigo e façam um resumo curto.
O objetivo desta aula é que conheçam como ocorre a biomineralização no tecido ósseo.
Boa leitura !
Boa feriado na semana que vem !
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Dentinogênese e Amelogênese - modelos para estudo de amelogênese - Aula 5 - 15/09/2023
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Aula com professor convidado: Prof. Dr. Sérgio Roberto Peres Line, da FOP/UNICAMP
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Faça um resumo da palestra de hoje
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Neste capítulo a proposta é a leitura de um artigo sobre proteínas e sua ação na formação do esmalte, além de uma aula de uma pesquisadora da Universidade da Califórnia (Dra. Janet Moradian-Oldak), gravada em 2012, e que será disponibilizada para vcs poderem assistir.
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Esse resumo é necessário para atribuição de presença.
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Defeitos de esmalte Índice de Defeitos de esmalte (DDE) e grupo Internacional de Defeitos de Esmalte (grupo 3D)
Boa tarde,
Hoje temos um tempo reservado para conhecer os defeitos de esmalte.
Basicamente, vamos relembrar:
O esmalte é formados por ameloblastos, células bem especializadas/diferenciadas, e que não são substituídas no caso de serem perdidas.
Na fase secretória, eles produzem uma matriz rica em proteínas.
AQUI TEMOS A 1ª DICA: qualquer impacto físico no germe dentário que leve à morte destes ameloblastos ou alterações graves no metabolismo celular destes ameloblatos, ou ainda deficiências nutricionais de proteínas ou deficiências nutricionais graves decorrentes de problemas de absorção de nutrientes pelo intestino (doença celíaca, por exemplo) vão levar a defeitos de esmalte que surgem nesta fase. Estes defeitos são chamados de HIPOPLASIAS, e são defeitos em que falta esmalte “em espessura”
Na fase de maturação, os ameloblastos são essenciais para que a matriz proteica do esmalte mineralize completamente.
Os defeitos que acontecem nesta fase são defeitos de cor e translucidez do esmalte e se chamam hipomineralizações ou hipomaturações.
Estes defeitos estão discutidos no artigo em português que anexo hoje para vc.
Este artigo discute os defeitos de esmalte e faz sua descriçäo, caracterizaçäo por fotografias, exemplos de outras especialidades médicas em que eles säo pesquisados e os índices utilizados para levantamentos epidemiológicos. Este artigo traz também um questionário que traz sobre possíveis causas para estes defeitos,
A seguir, para quem quiser ler mais, coloco um capítulo de livro (Pindborg JJ: Pathology of the dental hard tissues, Ed. W.B. Sauders Company, 1970) para mostrar que já há 5 décadas eram bem caracterizados vários defeitos de esmalte associados a doenças genéticas, febres, doenças virais/infecções, deficiências nutricionais, doenças severas do coração, doenças gastrointestinais (principalmente doença celíaca) e doenças endócrinas. O fato de tantas doenças diferentes afetar o esmalte decorre, principalmente, de o esmalte ser um tecido que tem células epiteliais com alta demanda energética, distantes da fonte de nutrição (os vasos), e que registram as suas carências em uma matriz que não se modifica.
Como eu comentei na conversa que tive com os alunos que estavam online, nas duas últimas décadas houve um aumento muito grande da prevalência de defeitos de esmalte, principalmente do tipo “hipomaturação/hipomineralização” em pessoas que não têm doenças sistêmicas que se note, o que é diferente dos defeitos de esmalte descritos no capítulo do livro de Pindborg, de 1970. A prevalência deste tipo de defeito de hipomineralização atual chega a 1 criança em 5, o que é uma alta taxa. As causas para o aumento destes defeitos não se conhece com certeza ainda, mas acredita-se que várias causas chamadas “ambientais” estejam associadas, entre elas a exposição a flúor, alguns tipos de antibióticos, alguns tipos de produtos agrícolas, entre outros agentes que ainda não se sabe.
Existe um grupo internacional que busca criar um movimento para colaborar com as famílias que têm crianças com defeitos de esmalte (defeitos graves, que levam à perda do dente, muitas vezes, além de causarem muito sofrimento e ter alto custo para a substituição do dente ou restauração). Este grupo também incentiva a pesquisa científica nesta área. É o grupo 3D.
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Este é um dos capítulos mais importantes e mais desconhecidos do Esmalte Dentário.
Por esta razão, é preciso ter muito cuidado com trabalhos sobre minerais no esmalte. Muitos destes artigos têm erros bastante graves.
Como vimos nas aulas anteriores, o esmalte tem várias diferenças em relação aos demais tecidos mineralizados. Do ponto de vista da distribuição de minerais, a principal diferença é que há no esmalte, na superfície externa do esmalte que reveste a coroa, um gradiente de concentração de alguns elementos, e isso reflete o quanto estes elementos interferem com a precipitação ou a dissolução da hidroxiapatita. Em outras palavras, como todo elemento químico ionizável, em solução, modifica o seu comportamento na presença de outros elementos químicos, isso têm reflexo na precipitação da hidroxiapatita no esmalte. Para ler mais sobre isso, recomendo a parte final do capítulo de livro "Ameloblastos" (vou anexar), onde há uma descrição um pouco curta, mas talvez suficiente, de como é a precipitação dos minerais no esmalte.
E alguns elementos favorecem a precipitação de sais em solução. É o caso do flúor, por exemplo, em soluções aquosas que tem fosfato e cálcio. E exatamente por este motivo que se achou vantajoso por algum tempo usar flúor na prevenção de cárie. Esse tempo já passou, mas não vamos discutir isso aqui.
Assim, o flúor justamente é um elemento que se concentra na superfície do esmalte, por onde ocorre o ingresso da maior parte dos minerais ao longo da fase de maturação. Mas não é apenas o flúor que se concentra na superfície do esmalte. Aí se concentra também o chumbo, um elemento químico que é uma neurotoxina conhecida.
Na aula de hoje, eu vou sugerir um capítulo de livro chamado "Mature enamel" para vcs verem como já faz bastante tempo que se sabe que há uma distribuição bem diferente dos diferentes íons no esmalte. Se vcs não tiverem tempo de ver tudo, pelo menos olhem os gráficos.
E vou anexar os artigos de chumbo que fizemos aqui em Ribeirão Preto, mostrando que o esmalte dentário é um bom marcador para a contaminhação ambiental por chumbo.
Além dos artigos, vou indicar a leitura (para quem quiser saber mais sobre a neurotixicidade do chumbo) do artigo que abre uma edição da revista Medicina (de 2009), que têm artigos de diferentes especialistas sobre a questão do chumbo. Há inclusive um artigo sobre com medir chumbo e os diferentes biomarcadores de exposição.
O artigo que abre o Simpósio "Chumbo e a Saúde Humana" é este: https://www.revistas.usp.br/rmrp/article/view/238/239
O conteúdo do Simpósio todo (todos os artigos) está neste link: https://www.revistas.usp.br/rmrp/issue/view/36
Tomara que este assunto os entusiasme, e assim venham a estudar e nos ajudar a conhecer melhor a distribuição de elementos químicos nos tecidos mineralizados.
Atenciosamente, Raquel.
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Nesta aula mostramos a evolução da cárie no esmalte dentário, algumas vezes descrita como a história natural da doença, com imagens de cortes histológicos.
A cárie começa no esmalte como alteração de cor (e é vista então como mancha branca). Neste estágio, normalmente basta mudar a dieta e instituir as medidas de higiene oral para "paralisar" a perda mineral (caso não seja uma pessoa com alterações de produção de saliva ou uma pessoa com outras alterações no esmalte, como defeitos de esmalte). A cárie paralisada ainda ficará uma mancha branca, mas não irá progredir. Isso porque a camada superficial, que terá ganhado mais minerais que a parte profunda, na maioria das vezes impede a mineralização da parte profunda e por isso a lesão branca permanece.
Discutimos a importância de se usar o conhecimento para prevenção de cárie e como esse conhecimento precisa se espalhar pela sociedade. Que conhecimento? De que o esmalte é a rocha que reveste a coroa dos dentes, rocha de hidroxiapatita, um fosfato de cálcio, que é dissolvido por ácidos, seja na rocha do dente, seja na rocha de cavernas! E o ácido é produzido pelas bactérias, pois em geral ácido é o produto final do metabolismo da maioria das bactérias (e também das nossas células, claro !). E bactérias estão em várias partes do nosso corpo, por exemplo no tubo digestivo, cuja entrada é a boca. E há todo tipo de bactéria na boca. Aliás, as bactérias que crescem são aquelas mais adaptadas ao meio. E quem controla isso? O dono da boca, que as alimenta ao se alimentar. MAS as bactérias da boca adquirem uma super vantagem se o dono da boca der a elas o açúcar branco, tecnicamente chamado de SACAROSE. Com a sacarose certas bactérias adquirem uma grande vantagem competitiva, pois elas usam a sacarose para produzir o polissacarídeo extracelular, PEC, e com ele se alimentam nos períodos em que o hospedeiro não se alimenta, além de conseguirem formar uma colônia que se prende mais firmemente à superfície da rocha-esmalte.
Esta descrição é muito conhecida, e precisa chegar em todos os brasileiros, para que cada pessoa possa fazer uma decisão consciente sobre dissolver o seu esmalte, que só é produzido em dois momentos na vida: quando se formam os dentes de leite e quando se formam os dentes permanentes.
Discutimos como a saliva tem Ca e P que mantém a integridade do esmalte, razão por que o esmalte está sempre se dissolvendo e se remineralizando.
Eu sugeri dois artigos relativamente antigos: um artigo que apresenta a cárie (e muito do que contei acima) para quem não é dentista (ano 2000).
E o outro artigo que mostra como se vê a cárie no esmalte, este um artigo com mais de mil citações, que é escrito para o grupo de pesquisadores do esmalte.
Também comentamos que há uma diferença de posição: há países que investem no conhecimento e prevenção de doenças decorrentes do consumo excessivo de açúcares industrializados (como os países escandinavos) e os países que não investem tanto nisso e acham que a prevenção de cárie pode ser obtida pela adição de flúor na água (como os EUA e muitos países que não discutem muito com a sociedade a sua política de saúde). A questão da cárie, embora gravíssima em muitos grupos sociais de muitos países, infelizmente ainda é a menor das questões do desconhecimento sobre o livre acesso a alimentos industrializados e ricos em açúcares não naturais. Muitas doenças crônicas que afetam gravemente a população de países como o Brasil e os EUA decorrem do consumo excessivo de alimentos industrializados e açucarados. Estão entre estas doenças o diabetes, a obesidade e a síndrome metabólica. Assim, é bastante importante pensar sobre o controle da microbiota com a alimentação, o que faz todo sentido do ponto de vista evolutivo para o melhor funcionamento de nossas enzimas do corpo inteiro (que evoluíram ao longo de milhões de anos... ao passo que esta dieta cheia de açúcares industriais tem menos de 200 anos!), e também para a conservação da rocha-esmalte que só é produzida em dois momentos da nossa vida. Como já explicado.
Finalmente, comentamos a respeito das pesquisas sobre cárie dentária, que em geral usam esmalte bovino, e induzem a cárie com ácido (modelo químico) ou induzem a cárie com as bactérias cariogênicas, que são então alimentadas e produzem os ácidos que desmineralizam o esmalte dentário (modelo biológico). Tanto o modelo químico como o biológico podem ser feitos "in vitro", ou seja, sem usar voluntários humanos ou a boca de um animal. Mas nestes modelos "in vitro" não temos uma variável muito importante: a saliva. A saliva muda muito de pessoa a pessoa. Por exemplo o fluxo salivar de cada pessoa é diferente, assim como a capacidade "tampão" da saliva de cada pessoa (que é a capacidade de neutralizar os ácidos). E saliva e esmalte são inseparáveis, lembram? O esmalte é o precipitado (rocha) que se dissolve se os íons (Ca e Fosfato) diminuírem na saliva. Então vou mandar também um exemplo de artigo que usou cada um destes modelos.
Foi desenvolvido por vários pesquisadores, mas muitos pesquisadores maravilhosos da cariologia do Brasil, o modelo de cárie "in situ". Entre estes pesquisadores impossível não mencionar o nome do Prof. Jaime A. Cury, da FOP/UNICAMP. Neste modelo a saliva tem o seu papel preservado nos testes de cárie! Os blocos de dente bovino são colocados em resina e esta resina faz parte de aparelhos móveis, que se pode colocar e retirar da boca dos "voluntários". Estes voluntários estão permitindo o estudo da cárie no ambiente da boca de verdade, com a saliva, tão essencial para se estudar a cárie. Neste modelo ("in situ") as bactérias crescem em um hospedeiro de verdade. É bem interessante !
A parte final, para pensar, eu não falei na aula gravada. É a parte que nos cabe do conhecimento, da ética do conhecimente e da nossa responsabilidade com os nossos semelhantes quando conhecemos algo que diz respeito a todos, ao bem comum. Quando vcs lerem sobre os estudos de Wipeholm (https://en.wikipedia.org/wiki/Vipeholm_experiments), estudos essenciais para se descobrir a causa da cárie, vão também ler sobre como estes estudos são hoje inaceitáveis do ponto de vista ético. É importante ler o link em inglês, pois a descrição em português não é a mesma e partes importantes estão suprimidas para se ter a ideia de como os estudos foram planejados.
Por outro lado, hoje, também não seria inaceitável do ponto de vista ético atualmente termos cantinas com balas e guloseimas em escolas? Ou ter uma criança crescendo, sem que os responsáveis saibam sobre os impactos da alimentação com refrigerantes e doces sobre os dentes e o organismo em geral e se responsabilizem por cuidar direitinho da criança?
Os estudos de Wipeholm foram planejados num tempo em que não se sabia o que causava cárie. E o governo sueco precisou mandar soldados para a II Guerra Mundial e eles tinham muitos dentes cariados que depois iam dar dor de dente. Olha só ! E era uma preocupação isso. E quando eles descobriram a causa, ah, se arrependeram dos estudos de Wipeholm, claro, mas correram a fazer alguma coisa, e esta coisa tem a ver com educar a sua sociedade a comer doces apenas num dia da semana, que foi o sábado a tarde, na frente da TV, com um grande investimento em propaganda, que resultou em a Suécia e os países escandinavos em geral serem países com baixíssimos índices de cárie.
Mas e nós de outros países. E no nosso tempo, 2023: sabemos a causa da cárie, mas isso é tratado tecnicamente pelos especialistas. Isso é correto? Ou toda a sociedade precisa ter este conhecimento e usá-lo eticamente para cuidar das crianças, para que não percam a rocha-esmalte que não será formada nunca mais na vida.
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Hoje falaremos da principal doença genética que afeta o esmalte dentário, a AI, ou Amelogenesis Imperfecta. Este é um termo genético internacionalmente descrito e que deveria ser usado desta forma, pelo menos pelo pesquisadores e pessoas que já tiveram acesso à norma científica sobre a nomenclatura de doenças. No site da Wikipedia, vcs poderão ler sobre a AI em inglês e em português aparece o termo AI traduzido como "Amelogênese Imperfeita" para o português, o se justifica porque a Wikipédia é escrita para leigos, que não cursaram disciplinas de genética ou esmalte dentário. Entretanto, a norma do uso de nomenclaturas deve sempre ser seguida por pesquisadores, usando-se o termo em latim e escrevendo o termo em itálico, quando for possível.
Eu selecionei dois artigos que achei bem interessantes para vcs lerem esta tarde.
Como de costume, eu irei apresentar os dois artigos a vcs na aula gravada, mas, como é bem ineficiente eu falar muitos detalhes, eu vou resumir os artigos e vcs terão oportunidade de abrir os artigos e ver suas fotos e os genes afetados por mutações que causam AI com calma, por conta própria.
A condição clínica dos pacientes com AI é na grande maioria dos casos bastante dramática, requerendo tratamento de todos os dentes da boca, o que indica uma necessidade que é muito cara e de difícil tratamento por muitas razões (financeira, a necessidade de várias especialidades, o fato de ser difícil fazer tratamentos restauradores duradoutos na idade da dentição mista, idade dos 7-13 anos, quando a criança/jovem ainda tem alguns dentes de leite e outros permanentes). Uma dificuldade adicional é o fato de as crianças e jovens com certos tipos de AI terem muita dor, e por isso sua condição é mais difícil de tratar pela expectativa de dor com o tratamento. Claro, como vcs verão, nem todos os casos de AI afetam a dureza do esmalte a ponto de a pessoa precisar de tratamento em todos os dentes. Mas um número muito grande de casos afeta sim o esmalte de modo a requerer a substituição do esmalte por coroas, pois o esmalte não tem mais a dureza e resistência necessárias para o desempenho das suas funções na boca.
A AI na dentição permanente é bem mais dramática do que na dentição de leite. E é um questionamento recorrente este dos alunos: por que os pacientes com AI reclamam mais e procuram ajuda na dentição permanente? Uma vez que na dentição de leite, por ser uma doença genética, também há defeitos de esmalte, mas os problemas não são tão graves, a ponto de muitas vezes as famílias realmente procurarem ajuda só na dentição permanente... a minha explicação para isso (que pode estar errada) é que os desafios mastigatórios dos dentes de leite, com a força da mastigação dos músculos de jovens, provavelmente são bem maiores, o que torna o esmalte menos resistente mais quebradiço. Além disso, penso eu, como a formação do dente de leite é mais curta, e sua espessura bem menor (pelo menos 14-1/3 da espessura do esmalte do dente permanente), talvez os processos de formação do esmalte de leite tenham um controle diferente e o esmalte do dente de leite ainda seja formado com melhor qualidade.
Existe um controle de qualidade na formação de esmalte, mas não vou falar aqui sobre isso. E existe uma controle da expressão de diferentes genes que é bem complexo, inclusive com metilação de genes, ou seja, há mecanismos que certamente podem explicar isso, mas eu não vou falar disso aqui. Em geral, quando menor a criança, e, portanto, quanto mais precoces os processos, mas preservada está a criança de alterações que o ambiente pode causar na expressão gênica. Não sei se esta é uma explicação útil, pois é um assunto realmente intrigante.
Outro fato é que, em muitos casos de AI, por haver dor e ser uma condição muito debilitante, os pais, e principalmente as mães, vão procurar ajuda!!! E os dentistas precisam estar preparados para ajudar e encaminhar, se não souberem como tratar !!! Dois casos de famílias com AI já chegaram à FORP graças à aula gravada de esmalte dentário no site IPTV USP nos anos de 2007 e 2008. Isso mostra como é uma condição que precisa de atenção e que precisa de encaminhamento, com as famílias afetadas procurando informações.
Como vcs vão perceber, a AI é também a típica doença que permite ver que proteínas realmente são essenciais para formar esmalte. E, ao lado das proteínas estruturais e proteases do esmalte, que causam AI quando mutadas, há também genes mutados que causam AI e que codificam uma proteína cuja função na formação do esmalte ainda não é conhecida. Olha que interessante, não? Uma oportunidade para vcs !!!
A outra questão que precisamos salientar é que sempre num exame clínico a condição do esmalte como um todo deve ser observada e deve-se questionar sobre a condição do esmalte de familiares, pois há casos de AI de herança ligada ao X, pelo fato de a amelogenina estar no cromossomo X e Y.
Além disso, há casos de AI que estão presentes em síndromes, e estes casos sindrômicos precisam de encaminhamento.
Espero que esta aula contribua para a formação de vcs !
Boa leitura !!!
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Neste capítulo eu recomendo a leitura de 3 artigos.
O 1o é do Prof. Jim Simmer e colaboradores. Neste artigo há menção ao fato de 1/4 das mutações em genes que causam defeitos de esmalte serem em proteínas da lâmina basal. Isso mostra a importância de prestar atenção em outras estruturas cujo desenvolvimento requer intensa interação epitélio-mesênquima, como glândulas, cabelos e papilas linguais.
O segundo artigo mostra a evolução do conjunto de genes que é essencial para todos os processos de formação de tecidos mineralizados em animais, genes chamados SCPP, "soluble calcium binding phosphoproteins". São parte deste grupo todas as proteínas estruturais do esmalte, como a amelogenina, ameloblastina, enamelina e ODAM.
O 3o artigo que recomendo fala da evolução da amelogenina e mostra as sequências de aminoácidos das amelogeninas de diferentes espécies. É um artigo curto e interessante, e já prepara vcs para nossa última aula.
Atenciosamente, Raquel
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Prezados alunos,
nesta aula vamos pensar um pouco como podemos extrair proteínas de um tecido.
Para isso eu separei o assunto em 2 tópicos:
1- extração de proteínas do esmalte "imaturo", ou em formação, e
2- extração de proteína do esmalte maduro.
1. Extração de proteínas do esmalte imaturo ou matriz do esmalte da fase secretória:
esse provavelmente é um assunto para quem quiser estudar as proteínas do esmalte em formação... a maioria de vcs, alunos de graduação, acho que não vão se interessar muito por este assunto. Pulem para o tópico abaixo (2).
O esmalte imaturo é uma matriz proteica já mineralizada em 30% e que contém bastante água, embora menos que os demais tecidos "moles". Vamos relembrar? O esmalte em formação, na fase secretória, é 1/3 proteínas, 1/3 água e 1/3 mineral. Isso mesmo, mesmo a matriz recém depositada pelos ameloblastos já está parcialmente mineralizada ! Eu provavelmente chamei a atenção de vcs para este fato que é diferente no esmalte em relação aos demais tecidos mineralizados do corpo (osso, dentina e cemento).
Agora vamos pensar um pouco com uma pequena conversa sobre extração de compostos... uma vez que a maioria dos alunos matriculados não têm um "background" em química de proteínas. É bem rápido, por favor não parem de ler ainda !
A extração é o processo que usamos nos laboratórios para "extrair"/retirar o que queremos de uma solução complexa de compostos. Há diferentes matrizes, que não precisam ser necessariamente a água, por exemplo há extrações alcóolicas ou de agentes bastante hidrofóbicos, mas no caso da matriz do esmalte em formação, da qual queremos retirar proteínas, os trabalhos fazem extrações em água, que é o solvente universal para moléculas hidrofílicas dos tecidos de mamíferos. Desde as primeiras descrições, a extração de proteínas do esmalte foi feita em diferentes etapas. Isso permite que se obtenha diferentes conjuntos de proteínas, diminuindo a complexidade e facilitando o estudo. Além disso, pode-se, no final, descalcificar a matriz do esmalte em formação, e assim poderemos recuperar também o conjunto de proteínas que estavam ligadas ao componente inorgânico. Então, pensando um pouco... se fizermos uma "extração" aquosa com a intenção de retirar proteínas de uma mistura complexa, o que vai determinar que algumas proteínas "venham para a solução" e deixem os complexos protéicos que eu retirei do tecido, no caso a matriz do esmalte em formaçao? Vários fator, mas sem dúvida os mais importantes são o pH da solução e a concentração de sais. Nos laboratórios de bioquímica, biocel e fisiologia, onde os cientistas trabalham com proteínas, todas as solução tem o pH fisiológico e a concentração de cloreto de sódio do plasma/líquido intersticial. Então, uma primeira extração nestas condições permite a extração de proteínas do esmalte que seriam capazes e se mover por difusão mesmo no esmalte em formação, pois seriam proteínas que nestas condições estariam mantendo a sua estrutura tridimensional muito perto do real (pois ela depende das interações com a água). As proteínas "extraídas" a gente diz que estão no "extrato" (extract, em inglês). Caso se queira saber que outras proteínas existem na matriz de esmalte, mas que não foram recuperadas no extrato feito com tampão com pH neutro, pode-se seguir uma extração metódica mudando algumas condições: muda-se o pH, com isso proteínas ligadas ao componente mineral ou mesmo a complexos proteicos começam a aparecer, pois os complexos vão se "desestabilizar', pois dependem da estrutura tridimensional das proteínas individuais estar preservada... e ela na verdade é muito afetada pelo pH. Foi desta forma que o grupo de cientistas japoneses descreveu várias proteínas do esmalte, com técnicas clássicas de cromatografia em coluna feita com uma extração seriada: primeiro um extrato neutro, depois um extrato feito em pH básico, depois um extrato em pH ácido. Sempre há a possibilidade de se aumentar a concentração de sal, e se formos aumentando aos poucos, também teremos diferentes proteínas "saindo" do complexo proteico do tecido para a solução aquosa. O extrato feito com concentrações maiores de sal é menos brando do que o extrato com mudança de pH (claro que não estou falando de pH extremos). O sal "rouba" as interações com a água que a parte externa das proteínas tem, pois os sais em geral são muito hidrofílicos. Com menos moléculas de água para interagir com sua estrutura, as proteínas "denaturam", ou seja, tem alterações na sua estrutura tridimensional, e o resultado disso é uma agregação e instabilidade. Nestes casos de aumento das concentrações de sal nas soluções, as proteínas passam a ser recuperadas no "pellet", que é o que fica no fundo do tubo de ensaio após a centrifugação, e não mais no sobrenadante, como nos extratos obtidos inicialmente com mudança de pH tampão... para quem já tem mais experiência em laboratório, talvez se lembre que este processo de ir aumentando o sal para "retirar/extrair" moléculas muito hidrofílicas e que dependem das pontes de hidrogênio para se manterem em solução é chamado de "salting-out", e é usado para purificar múltiplas coisas, não apenas proteínas. ;-)
Bom, minha gente querida, isso como introdução para os futuros bioquímicos do esmalte. Para quem quiser saber mais, vou recomendar os estudos abaixo. Uma emoção ver como bioquímicos japoneses tenazes faziam essas extrações metódicas por dias, tudo em gelo, com inibidores de proteases e inibidores de fosfatases*, usando depois diferentes métodos de separação, até chegar às proteínas puras do esmalte. Com as proteína puras, eles fizeram os sequenciamento dos aminoácidos (na época... anos de 1980, era isso que se fazia) para podermos conhecê-las ! Orgulho !!! Vcs precisam lembrar que naquela não se tinha à disposição o genoma das espécies animais mais comuns sequenciado. E é importante notar que vcs SEMPRE verão que a bioquímica de proteínas do esmalte é estudada a partir de espécies de animais em geral grandes, como porcos e bovinos, pois as proteínas tem que ser extraídas de germes dentários, que não se pode coletar em grandes quantidades de humanos no período fetal. E, mesmo nesta disciplina, vcs já aprenderam que as diferenças entre as espécies são mínimas, não havendo justificativa científica para estudar em humano proteínas de esmalte. Finalmente, se vcs pensaram na amelogenina... terão talvez lembrado que ela é uma proteína bastante hidrofóbica, com a parte inicial (N-terminal) e final (C-terminal) hidrofílicas. Na hora de purificar amelogeninas, os melhores métodos usam coluna altamente hidrofóbicas e HPCL, ou seja, cromatografia líquida em alta pressão.
Recomendo vcs abrirem o artigo para ver pelo menos os métodos e as imagens, aqui Yamakoshi e colaboradores purificaram a maior parte das amelogeninas que acabaram de ser secretadas (eles retiraram uma camadinha fina da superfície do esmalte em formação). Eles usaram um tampão básico (carbonato, pH 10,8 !!!) e fizeram 3 extrações no mesmo tampão para ter certeza que estavam extraindo o máximo de proteínas que podiam. As sequencias das diferentes amelogeninas aparecem descritas com o código de 1 letra para cada aminácido. Para saber o nome do aminácido basta procurar um tabela com o código.
Artigo "Porcine Amelogenins" De Yamakochi Y et al., Calcified Tissues International, 1994.
Outros artigos interessantes sobre este assunto são:
Termine et al. Enamel matrix: structural proteins. J Dent Res, 1979. https://doi.org/10.1177/00220345790580022901
* Neste artigo acima vcs encontram no próprio resumo: "Approximately fifteen percent of the total matrix consisted of much higher molecular weight phosphoproteins (46,000 - 72,000 daltons) whose amino acid composition closely resembled that reported for mature enamel protein. These high molecular weight proteins were tightly bound to the fetal enamel apatite crystallites." Então vejam como é importante a presença de fosfatos covalentemente ligados nas proteínas dos tecidos mineralizados. É por intermédio dos fosfatos que as proteínas ficam ligadas no mineral. E no esmalte, como dito nesta frase que eu copiei aqui, eles acharam 15% de fosfoproteínas no esmalte imaturo. Para saber a definição de fosfoprotéina, busquem "phosphoprotein" na wikipedia.
E eu acabei conhecendo em mais profundidade este assunto de como se extrai proteínas do esmalte porque no meu doutorado eu fazia extrações de proteases do esmalte para verificar se o fluoreto de sódio tinha efeitos sobre a atividade delas. Um dos artigos publicados sobre este assunto é este:
doi: 10.1034/j.1600-0722.2000.00735.x.2. Extração de proteínas do esmalte maduro
O esmalte maduro é um tecido com poucas proteínas: menos de 1% do seu peso, supostamente. Mas mesmo as medidas para se chegar a este número são muito difíceis de fazer. Mas se consegue sempre recuparar alguns peptídeos remanescentes no esmalte maduro. Além disso, no esmalte hipomineralizado (na MIH, por exemplo) há descrição de haver proteínas estranhas no esmalte. Para maiores detalhes, recomendo o artigo Perez et al., 2020 (doi: 10.3389/fphys.2020.579015).
No caso do esmalte de todos nós, pessoas vivas, ou mesmo o esmalte de 2 milhões de anos, de nossos ancestrais, ele é fonte suficiente de peptídeos de esmalte a ponto de novas espécies de hominídeos terem sido caracterízadas exclusivamente a partir do proteoma do esmalte maduro. Isso não é absolutamente M A R A V I L H O S O ???
Ficam aqui então as dicas de artigos:
a) um artigo que foi o primeiro em que caracterizamos que era possível ter informações precisas das proteínas de esmalte maduro (por espectrometria de massas) sem precisar fazer a análise de muitos dentes.
Porto et al., Recovery and identification of mature enamel proteins in ancient teeth. Eur J Oral Sci. 2011 Dec;119 Suppl 1:83-7. doi: 10.1111/j.1600-0722.2011.00885.x.
b) o artigo em que descrevemos como recuperar peptídeos de esmalte a partir de um extrato ácido superficial está aqui:
Stewart NA, Molina GF, Issa JPM, Yates NA, SOsovicka, Vieira AR, Line SRP, Montgomery J, Gerlach RF. The identification of peptides by nanoLC-MS/MS from human surface tooth enamel following a simple acid etch extraction. Royal Society of Chemistry Advances. The identification of peptides by nanoLC-MS/MS. DOI: 10.1039/c6ra05120k
Esse artigo surgiu com um projeto de Iniciação Científica de Gabriela Ferian Molina. Então acredito que possa ser muito inspirador para o pessoal da Graduação.
Foi a partir da prova de que se consegue retirar peptídeos da superfície do esmalte, com mínimo dano aos dentes, que fizemos este trabalho abaixo, com amostras de dentes de vários museus da Inglaterra, determinando com os peptídeos do esmalte o sexo de restos mortais (pois a amelogenina têm peptídeos dimórficos).
doi: 10.1073/pnas.1714926115.Stewart NS, et al. Proc. Natl Acad Sci U S A. 2017 Dec 26;114(52):13649-13654.c) aqui vai ainda um artigo caracterízando uma nova espécie de hominídeo (Homo antecessor) exclusivamente a partir do proteoma do esmalte dentário. Se vcs olharem, esta área teve um crescimento enorme nos últimos anos, no sentido de haver novos artigos científicos de novas espécies de animais fósseis caracterizadas a partir do proteoma do esmalte em grantes revistas revistas científicas.
Welker, F., Gutenbrunner, P., Mackie, M., Tiwary, S., Chiva, C., Dickinson, M. R., Kuhlwilm, M., De Manuel, M., Gelabert, P., Margvelashvili, A., Arsuaga, J. L., Carbonell, E., Penkman, K., Sabidó, E., Cox, J., Olsen, J. V., Lordkipanidze, D., Racimo, F., María, J., . . . Cappellini, E. (2020). The dental proteome of Homo antecessor. Nature, 580(7802), 235-238. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2153-8
Espero que tenha sido útil nossa disciplina e que vcs tenham gostado de ver este tecido tão interessante por novos ângulos !!!
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Resuma em poucas linhas o assunto da aula. Esta é uma forma de eu atribuir presença aos alunos matriculados.
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Artigo extração de amelogeninas por Yamakoshi et al., 1995. Esse é um artigo que mostra para vcs um pouco de como são estudadas as proteínas que vcs viram descritas nos artigos de revisão sobre esmalte. Este artigo é mais ou menos um dos pés do piano. É legal saber do esmalte etc... assim como é muito legal tocar piano, mas tem um trabalho duro por trás, de que nem sempre a gente lembra. Mais ou menos como o pé do piano. ;-)
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Este artigo descreve a extração de peptídeos do esmalte maduro.
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Nesta foto aparecem algumas das pessoas que escreveram muitos artigos sobre esmalte dentário que vcs conheceram ao longo deste semestre.
Vejam por exemplo, da esquerda para a direita, atrás (de pé):
1. James (Jim) P. Simmer; na época da foto estava estabelecendo seu grupo de pesquisa com proteína do esmalte, no Health Science Center na University of Texas at San Antonio. Hoje ele está com o mesmo grupo, mas em uma outra universidade americana.
2, a esposa dele, Jan C.-C. Ju, que é provavelmente a pessoa que mais conhece AI no mundo, com estudo de muitos casos clínicos. Ela é uma Odontopediatra que trabalha também com genética molecular e colabora bastante nos estudos com os camundongos K.O. (knock-out, onde um gene foi deletado ou inativado) para as proteínas do esmalte.
3. Yasuo Yamakoshi, um japonês que foi fazer Pós-Doc no lab do Prof. Jim Simmer. O Dr. Yamakoshi foi quem escreveu o artigo da purificação de amelogeninas que eu disponibilizei na seção de extração de proteínas do esmalte imaturo, tendo sido os resultados deste artigo parte do seu Doutorado. Ele trabalhou 7 anos no Lab do Prof. Jim Simmer, nos EUA, e depois voltou ao Japão, onde trabalha até hoje no grupo de Bioquímica de proteínas de esmalte na Universidade de Yokohama.
4. Atrás ainda está Xiaohang Cao, com quem eu trabalhei por 6 meses diretamente, enquanto aprendia a expressar do esmalte em bactérias.
Na frente, da esquerda para a direita:
5. Chuhua Zhang. 6. Ying Yang. 7. Esta que vos escreve. 8. Okhee Riu (que fez ótimos trabalhos sobre a a serina-protease que tem no esmalte, hoje chamada de KLK-4), infelizmente já falecida. 9- Xiaoling Sun.
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Nos dias 08 e 15/12 estão sendo as apresentações dos trabalhos.
Conforme dito na Ementa da disciplina, há um trabalho final que deve ser apresentado em duplas. Caso a/o aluna/aluno não tenha dupla, pode apresentar sozinho. Não podem ser três alunos em um grupo.
O tempo de apresentação é de 3-5 minutos.
Pode ser um vídeo, pode ser uma explicação sobre um modelo 3D, pode ser uma explicação sobre alguma parte ou processo que acontece no esmalte em desenho, pode ser algo diferente disso, mas que inclua vcs falando e explicando algum processo ou estrutura ou microestrutura ou nanoestrutura do esmalte. Ou podem falar sobre a saliva e sua relação com o esmalte (embora eu nem tenha tido como falar disso nessa disciplina!).
Quem não puder apresentar no dia 08/12, pode apresentar no dia 15/12.
Não vou fazer uma lista, por isso conto com vcs na aula online, para também prestigiarem o trabalho dos colegas !
Boa sorte e obrigada pela atenção e interesse !!!
P.S. Se puderem, depois de finalizarmos a disciplina, mandem uma mensagem no espaço que vou abrir para isso. Com sugestões. Não vai ter nada a ver a mensagem de vcs com sugestões sobre a nota !!! A mensagem visa me ajudar a reunir assuntos interessantes para deixar um livro sobre esmalte. Então, principalmente as partes que precisam melhorar ou algo que vcs gostaram.
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Olá
Ajudem-me a compreender se a ordem dos assuntos fez sentido para vcs.
Eu também achei que esta disiplina poderia ter mais horas, para que vcs também tivessem os créditos. Eu achei que no final ela irá precisar de um tempo maior, pois o tempo para ler os artigos que eu sugeri foi muito curto.
Eu gostaria de saber em particular se o formato de uma aula introdutória curta seguida de um texto meu e as sugestões de artigos foram boas.
Esta é a 1a versão desta disciplina, e por isso as sugestões e comentários de vcs são muito importantes.
Agradeço muito pelas sugestões.
Atc, Raquel