04 - Genética e Biologia Molecular

Graças à tecnologia do DNA recombinante, os genes podem ser isolados em tubos de ensaio e caracterizados como sequências específicas de nucleotídeos. Quando caracterizada, uma sequência pode ser manipulada com o propósito de alterar o genótipo de um organismo. A introdução de um gene alterado em um organismo é importante sob o ponto de vista da genética básica, e é um tópico que tem ampla aplicação comercial. Dois exemplos desta última são: (1) cabras que secretam em seu leite antibióticos derivados de um fungo, e (2) plantas que não congelam devido à introdução, em seus genomas, de genes anticongelamento isolados de um peixe do Ártico.

O uso das técnicas de DNA recombinante para alterar o genótipo e o fenótipo de um organismo é chamado engenharia genética. As técnicas de engenharia genética foram originalmente desenvolvidas em bactérias, e depois estendidas aos eucariotos, especialmente, àqueles empregados como modelos em pesquisas. Sendo assim, genes de um eucarioto são introduzidos em outro, da mesma espécie ou não. O gene transferido é chamado transgene e o organismo modificado é chamado transgênico.

O transgene pode ser introduzido em uma célula eucariótica por uma variedade de técnicas, inclusive a transformação, microinjeção, infecção bacteriana ou viral, ou bombardeamento com partículas de ouro ou de tungstênio revestidas de DNA (Figura 1). Após sua entrada na célula, o transgene é capaz de migrar para o núcleo, onde pode se inserir em um cromossomo, tornando-se estável no genoma, ou pode se manter não integrado e atuar como um plasmídeo.

Figura 1 - Métodos diferentes utilizados para introduzir um DNA exógeno em uma célula

Engenharia Genética em Plantas

Por causa da sua importância econômica, muitas espécies de plantas têm sido alvo de pesquisas genéticas para o desenvolvimento de variedades melhoradas. A tecnologia do DNA recombinante introduziu uma nova dimensão a este esforço, especialmente, porque as modificações genômicas possibilitadas por esta técnica são quase ilimitadas. A diversidade genética não é mais obtida apenas selecionando variantes dentro de uma determinada espécie. O DNA de outras espécies de plantas, animais ou mesmo micro-organismos, pode ser introduzido na espécie receptora. Em resposta a essas novas possibilidades, setores da sociedade manifestaram preocupação de que o uso de organismos geneticamente modificados (OGM) como alimento pudesse causar problemas de saúde não previstos. A preocupação com os OGM é mais uma das facetas do debate público sobre novas tecnologias, trazendo mais uma vez à tona a discussão sobre aspectos de saúde, segurança, ética e educação (Animação 1).

Animação 1 - (A) Para produzir uma planta transgênica, utiliza-se um vetor de tamanho adequado para a clonagem do segmento de DNA de interesse. Esse vetor intermediário é recombinado com outro plasmídeo (DNA de interesse, ou seja exógeno) de interesse e gene de resistência a antibióticos como: canamicina (Kan^R), permitindo sua seleção do transgênico, entre as regiões que flanqueiam o T-DNA. Essas regiões flanqueadoras são necessárias para promover a inserção do T-DNA no cromossomo da planta. (B) Geração de uma planta transgênica após o crescimento de uma célula transformada pelo T-DNA.

Engenharia Genética em Animais

As técnicas de transgenia têm sido muito empregadas em animais-modelo, como o nematoide Caenorhabditis elegans, a mosca Drosophila melanogaster e o camundongo Mus musculus. Animais transgênicos podem ser produzidos pela injeção direta de DNA em embriões.

Em mamíferos, a injeção de plasmídeos também tem sido feita em ovos fertilizados. O ovo fertilizado possui 2 pró-núcleos, um deles recebe uma microinjeção com centenas de cópias do plasmídeo que contém o transgene. O DNA introduzido parece se integrar aleatoriamente em qualquer cromossomo e posição. O embrião se desenvolve e o DNA introduzido pode se tornar estável em ambos os tipos celulares, células somáticas e germinativas. Portanto, pode passar para os descendentes e se comportar como um gene nuclear normal.

Como nas plantas, os animais têm sido manipulados, não apenas para melhorar as características do próprio animal, mas também para atuar como uma fábrica de produção de proteínas de interesse. Por exemplo, o leite de mamíferos é obtido facilmente; portanto, é um meio muito conveniente para a obtenção de proteínas, pois não há necessidade de sacrificar o animal (Animação 2).

Animação 2 - Produção de uma proteína de interesse farmacêutico, secretada no leite de ovelha. O gene de interesse codifica a proteína ativadora do plasminogênio tissular (TPA). Essa proteína tem grande importância terapêutica, pois dissolve coágulos de sangue em humanos. O gene TPA é colocado sob o controle do promotor da β-lactoglobulina, cuja expressão é restrita ao tecido das glândulas mamárias. O vetor assim construído é introduzido, por microinjeção, no núcleo dos ovos fertilizados. Os ovos injetados são implantados no ovário de ovelhas de aluguel. A identificação dos filhotes que expressam o transgene é feita por PCR, utilizando-se primers específicos para o gene de interesse. As ovelhas transgênicas expressam esse gene apenas nas glândulas mamárias; desse modo, a proteína é secretada em grande quantidade no leite, o que permite a sua purificação.