Roteiro da Semana 5

Introdução

DNA: a receita da vida e seu código

O DNA é a principal molécula da vida, pois carrega em sua estrutura a informação hereditária que determina a estrutura das proteínas e as regras que direcionam o crescimento, a divisão e a diferenciação celulares. A composição química e a organização do DNA permitem um número infinito de combinações, o que pode ser percebido nas várias informações hereditárias que ele transmite. O DNA é a base do processo evolutivo.

Uma vez aceito que o DNA é o portador da informação genética, os esforços concentraram-se em decifrar a estrutura da molécula de DNA e os mecanismos pelos quais a informação nele armazenada é expressa para produzir uma característica ou fenótipo.

Atividade: veja como se faz uma extraçao de DNA clicando aqui.

Estrutura e Organização do Genoma

Estrutura do DNA

O DNA é uma longa macromolécula, semelhante a uma escada que se espiraliza para formar uma hélice dupla. Cada fita da hélice é um polímero linear composto de unidades chamadas nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto por um açúcar (desoxirribose no DNA e ribose no RNA), um grupo fosfato e uma base nitrogenada. No DNA, há quatro nucleotídeos diferentes dependendo da base nitrogenada presente: Adenina (A), Guanina (G), Timina (T) e Citosina (C). Essas quatro bases em milhares de combinações sequenciais especificam a sequência de aminoácidos das proteínas. A molécula do DNA tem duas cadeias açúcar-fosfato, que são mantidas juntas por pontes de hidrogênio formadas entre as bases nitrogenadas complementares: duas pontes de hidrogênio entre A=T e três pontes entre G=C.

A relação de complementaridade entre adenina e timina e entre guanina e citosina é essencial para a função gênica, servindo como base tanto para a duplicação do DNA quanto para a expressão gênica. Durante ambos os processos, as fitas de DNA servem como moldes para a síntese de moléculas complementares. Assim, para qualquer segmento de DNA, devido ao pareamento específico entre as bases, se a sequência de uma cadeia for conhecida, a sequência da outra também o será.

Animação 2

Organização do DNA

O DNA associado a proteínas (cromossomos) encontra-se dentro do núcleo celular nas células eucarióticas.

Na célula, a estrutura de cada cromossomo é altamente organizada. Mesmo no núcleo interfásico, a hélice dupla de DNA, de 2 nm, está sujeita a pelo menos três níveis de enrolamento. O nucleossomo é a unidade fundamental de empacotamento e consiste de um núcleo de oito histonas, proteínas básicas pequenas altamente conservadas, com 103 a 135 aminoácidos. O cerne é formado por duas moléculas de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4, e, ao redor dele, um segmento de 146 pb de DNA fita dupla se enrola em 1,75 volta. Os nucleossomos adjacentes são unidos por um DNA espaçador curto. A aparência desta estrutura em microscopia eletrônica é de um colar de contas.

A estrutura em colar de contas, com cerca de 11 nm de diâmetro, espiraliza-se formando um filamento de cromatina com 30 nm de espessura denominado solenóide ou fibra cromossômica. Esta solenóide forma várias alças ao se associar a um esqueleto de proteínas ácidas que sustenta o cromossomo; este nível de organização tem cerca de 300 nm de espessura e constitui o cromonema (filamento cromossômico na interfase). Durante a divisão celular, esse filamento cromossômico enrola-se ainda mais chegando a atingir 700 nm de espessura em cada cromátide no cromossomo metafásico.

A transcrição só é possível quando o cromossomo está no nível de organização “colar de contas” ou “DNA livre”.

Animação 3

Durante a divisão celular, os cromossomos se tornam cada vez mais condensados, chegando ao nível de 1:10000 de seu comprimento quando em completo relaxamento. As alças do filamento de cromatina de 30 nm, contendo 20 a 100 kb de DNA por alça, estão ligadas a uma haste central. Esta consiste de proteínas não-histonas, ácidas.

Animação 4

Grande parte da cromatina é localizada na periferia do núcleo, possivelmente pelo fato de que uma das principais proteínas associadas com a heterocromatina se liga a uma proteína da membrana nuclear interna.

Conhecem-se dois tipos de cromatina:

Eucromatina, que consiste em DNA ativo, ou seja, que se pode expressar como proteínas e enzimas.

Heterocromatina, que consiste em DNA inativo e que parece ter funções estruturais durante o ciclo celular.

Heterocromatina constitutiva, que nunca se expressa como proteínas e que se encontra localizada à volta do centrômero (contém geralmente sequências repetitivas).

Heterocromatina facultativa, que, por vezes, é transcrita em outros tipos celulares; consequentemente, a sua quantidade varia dependendo da atividade transcricional da célula. Apresenta-se condensada na intérfase.

Animação 5

Tipos de DNA

• 45% DNA DE CÓPIA ÚNICA (5% codifica para proteínas): presente uma única ou poucas vezes no genoma.
• 55% - DNA REPETITIVO:  Sequências que aparecem de modo repetido (milhares de vezes)  no genoma:
  • DNA Repetitivo Disperso (45%) - tende a estar espalhado individualmente por todo o genoma.  Não ocorrem em tandem (sequência repetitivas).  As formas mais comuns são os Elementos Intercalares curtos (SINEs)  e Longos (LINEs).
  • DNA satélite (10%): são sequências formadas por unidades de nucleotídeos repetidas em tandem, agrupadas em certas regiões do cromossomos. Estas sequências geralmente não são transcritas.  Existem várias categorias de DNA satélite e alguns destes tipos formam os centrômeros e heterocromatina.

RNA

História da descoberta do modelo

Uma das grandes descobertas do século XX foi feita, em 1953, por James Watson e Francis Crick, que estabeleceram que as duas fitas de DNA são complementares, de modo que a hélice dupla, os degraus da escadas são sempre constituídos pelos pares A=T e G=C. Estas descobertas renderam à dupla (juntamente com Maurice Wilkins) o prêmio Nobel em 1962.

Duplicação semiconservativa

O considerável comprimento de um cromossomo humano exige que a duplicação se inicie em milhares de locais ao mesmo tempo, a fim de completar a síntese de toda a molécula dentro da fase S do ciclo celular.

Em caso de duplicação imprópria, a célula reconhece o erro e ativa o sistema de reparo de DNA: bloqueio do ciclo celular e apoptose.

Cada cadeia complementar do DNA funciona como molde para a síntese da nova cadeia durante a duplicação. Estudos de duplicação do DNA utilizando isótopos marcados N14 mostraram que os produtos da duplicação do DNA não incluíam a dupla hélice original, mas metade dela. Verificou-se que cada molécula-filha de DNA, após a duplicação, era composta por uma fita parental, e a nova era recém-sintetizada, contendo o N14 marcado. Dessa forma, comprovou-se que o processo era semiconservativo.

Evidências por microscopia eletrônica mostraram que o DNA, durante sua duplicação, formava estruturas em Y, que consistiam nas forquilhas de duplicação do DNA, indicando que a separação das duas fitas e a duplicação acontecia simultaneamente. Assim que a dupla hélice começa a se separar, as regiões da fita simples são utilizadas como molde, tornando-se imediatamente novas regiões de fita dupla.

Uma outra questão importante é referente à capacidade de duplicação do DNA em função do tempo. Verificou-se que a duplicação se inicia simultaneamente ou gradativamente em diversos pontos do cromossomo, formando fragmentos, chamados fragmentos de Okasaki, que posteriormente são todos ligados. A velocidade de síntese do DNA é de cerca de 1000 nucleotídeos por segundo.

Animação 6

A duplicação requer DNA pré-existente

Estudos realizados no final da década de 50, pelo pesquisador Arthur Kornberg, mostraram que a duplicação do DNA acontecia somente quando havia cadeias preexistentes de DNA para servir de molde. É interessante notar que a composição de bases do DNA produzido em tubo-teste foi idêntica à composição do DNA molde, mostrando que a última determina a composição da primeira.

A duplicação do DNA é realizada por um conjunto altamente complexo de proteínas e DNA polimerases. Esta maquinaria molecular é composta por nove proteínas que desempenham atividades diversas, inclusive ligar-se à fita de DNA, mover-se ao longo da fita, sintetizar uma nova fita, verificar se a síntese está correta e interagir com outras proteínas essenciais para o processo de duplicação. Além das polimerases, participam também do processo de duplicação as helicases, que atuam na desespiralização da hélice, as topoisomerases e outras proteínas, que diminuem a tensão criada pela desespiralização e estabilizam o DNA.

Desnaturação e renaturação do DNA

Em condições fisiológicas normais, as cadeias complementares do DNA não se separam espontaneamente, por causa do grande número de pontes de hidrogênio entre as bases das cadeias complementares.

Entretanto, em temperaturas próximas à ebulição ou em pH extremos, as duas fitas podem ser separadas, ou seja, desnaturadas. A desnaturação é reversível e o DNA é capaz de renaturação de forma perfeita, quando as condições originais são resgatadas. A renaturaçao é muito específica e produzirá uma dupla hélice perfeita quando as sequências de bases das duas fitas forem exatamente complementares.

Essa capacidade de anelamento do DNA, ou hibridização, constitui uma ferramenta fundamental utilizada, atualmente, nas técnicas de genética molecular.

O gene

O gene é o segmento de DNA com informação para a síntese de um polipeptídeo ou de um RNA. Todo gene se expressa por meio da transcrição gênica, que é o processo de síntese de RNA, que tem por modelo o DNA.

A unidade de transcrição gênica é o segmento de DNA que é transcrito de forma contínua em uma molécula de RNA. A transcrição ocorre no sentido 5´- 3´da fita molde (anti-senso) do DNA, e os nucleotídeos são sempre adicionados na ponta crescente 3´do mRNA Portanto a sequencia do mRNA será correspondente à FITA senso (animação 8). A unidade de transcrição gênica geralmente apresenta uma sequência que é a região promotora, onde se encaixa a polimerase do RNA, e uma sequência finalizadora, que determina o desligamento da polimerase do RNA da molécula de DNA modelo, completando o processo. Entre essas duas sequências, estão distribuídos, em número variável em cada gene, trechos de DNA que serão traduzidos em proteínas – os éxons – e trechos intercalares que não serão traduzidos – os íntrons.

A transcrição de um RNA tem início quando uma polimerase do RNA se encaixa na região promotora e separa, nesse local, as duas cadeias da molécula do DNA. A enzima passa então a orientar o encaixe de ribonucleotídeos nas bases de uma das cadeias do DNA, unindo-os à medida que os ordena na cadeia de DNA modelo. Dessa forma, transcreve tanto as regiões de éxons como as de íntrons, produzindo uma molécula de RNAm correspondente a toda unidade de transcrição. Ao atingir a sequência sinalizadora de término da transcrição, a polimerase solta-se do DNA e a transcrição termina. Nos eucariotos, a molécula deste chamado pré-RNA mensageiro sofre uma série de modificações, que incluem a remoção dos íntrons – splicing ou “corte e emenda” – e adição de nucleotídeos que conferem estabilidade a este mRNA. O corte dos íntrons é determinado por sequências específicas de nucleotídeos. O mRNA processado irá para o citoplasma, onde participa da síntese da proteína correspondente. Um mesmo pré-RNA pode ser cortado e montado de diferentes maneiras, dependendo do tipo de célula ou da fase de desenvolvimento, através do mecanismo de splicing alternativo. Esta é uma das explicações para o fato de um número aproximado de 25.000 genes humanos poder produzir mais de 200.000 proteínas diferentes.

Animação 7

Animação 8

Mutações: alterações nos genes

Mutações são alterações nos genes, isto é, uma alteração na sequência ou no número de bases na molécula de DNA que compõe um gene.

Figura 2

Se a alteração na sequência de aminoácidos na proteína não afetar o funcionamento da molécula e não prejudicar o organismo, de modo geral, ela passa despercebida, sendo indiferente.

Outras vezes, a alteração leva a um favorecimento. Imagine, por exemplo, que uma certa célula do seu intestino passe a produzir uma enzima chamada celulase, capaz de digerir a celulose dos vegetais que você come. Provavelmente, a mutação que levou a esse erro será vantajosa para você, que poderá eventualmente até se alimentar de papel picado.

Tipos de Mutações

Elas podem resultar na substituição, inserção ou deleção de apenas uma base, ou abranger deleções ou duplicações de grandes segmentos de DNA.

Mutações pontuais podem ser causadas por agentes mutagênicos ou erros na duplicação do DNA.

Quando uma mutação pontual de substituição de uma base ocorre dentro da região codificadora da proteína, ela pode ser classificada como:

Mutação silenciosa: a mudança de base não altera a tradução do códon, mantendo o mesmo aminoácido.

Mutação de sentido trocado ou "Missense": a mudança da base causa uma mudança do aminoácido, que, dependendo de seu papel na estrutura da proteína, pode ser mais ou menos deletério para a sua função.

Mutação sem sentido: a mudança de base leva a um códon de parada, que interrompe a proteína antes de seu término.

Uma mutação pontual pode ocorrer também por:

Deleção ou inserção: quando ocorre a remoção ou a adição de um ou mais nucleotídeos da sequência de DNA. Essas mutações geralmente modificam o quadro de leitura do mRNA do gene, resultando na tradução de uma proteína truncada.

Figura 3

As mutações também podem ocorrer nos sítios de emenda do mRNA, causando alterações no mecanismo de splicing do gene envolvido, adicionando ou removendo segmentos do mRNA e da proteína.

Animação 9

Quanto à sua função, as mutações podem ser de:

Perda de função: quando o produto proteico resultante está ausente, modificado ou não funcional.

Ganho de função: quando o produto proteico é modificado, ganhando uma nova função, ou quando a função gênica ocorre no tecido errado ou no tempo errado.

Algumas mutações patogênicas alteram também a regulação e o funcionamento do próprio gene, ou atuam de forma anormal na regulação da expressão de outros genes.

Na anemia falciforme, a substituição do aminoácido ácido glutâmico pelo aminoácido valina, em uma das cadeias de hemoglobina, conduz a uma alteração na forma da proteína como um todo. Essa alteração muda o formato do glóbulo vermelho, que passa a ser incapaz de transportar oxigênio. Outra consequência grave é as hemácias com formato de foice grudarem umas nas outras nos capilares sanguíneos, o que pode provocar obstruções no trajeto para os tecidos.

Animação 10

As mutações são hereditárias

Dependendo da célula em que a mutação ocorre, ela pode ser transmitida à descendência. Quando as mutações são somáticas, evidentemente, não ocorrerá a transmissão dos genes mutantes para os filhos, pois elas ocorrem em células não envolvidas na produção de gametas.

Já quando a mutação é herdada, ela deve ter ocorrido no passado em células da linhagem germinativa de algum antepassado, que a transmitiu aos descendentes.

As causas das mutações

De maneira geral, as mutações ocorrem como consequência de erros no processo de duplicação do DNA. Acontecem com uma baixíssima frequência. Muitas delas, inclusive, são corrigidas por mecanismos especiais de reparo; por exemplo, a proteína codificada pelo gene p53 é essencial para proteger as células normais dos efeitos dos danos ao DNA e de outros estresses. Essa proteína está envolvida na interrupção do ciclo celular, na reparação do DNA e na morte celular programada. Os níveis dessa proteína são extremamente baixos nas células normais; mas, em células onde ocorreram danos ao DNA, os níveis de proteína p53 aumentam enormemente.

Há, no entanto, certos agentes do ambiente que podem aumentar a taxa de ocorrência de erros genéticos:

• substâncias existentes no fumo,
• raios X,
• luz ultravioleta,
• gás mostarda,
• ácido nitroso e
• alguns corantes existentes nos alimentos.

Não é à toa que, em muitos países, é crescente a preocupação com a diminuição da espessura da camada do gás ozônio (O₃), que circunda a atmosfera terrestre. Esse gás atua como filtro da luz ultravioleta proveniente do Sol. Com a diminuição da sua espessura, aumenta a incidência desse tipo de radiação, o que pode afetar a pele das pessoas. Ocorrem lesões no material genético, que podem levar a certos tipos de câncer de pele.

Bibliografia

THOMPSON & THOMPSON. Genética Médica.

WILLIAM S. KLUG, MICHAEL R. CUMMINGS, CHARLOTTE A. SPENCER e MICHAEL A. PALLADINO. Conceitos de Genética. 9ª EDIÇÃO. Editora: Artmed®.

WATSON J.D. RICHARD M. MYERS. CAUDY AMY A. WITKOWSKI, JAN A. DNA Recombinante - Genes e Genomas. 3ª EDIÇÃO. Editora: Artmed®.

STRACHAN T. e READ P. A. Genética Molecular Humana. 2ª EDIÇÃO Editora: Artmed®.

[Atividade] - Questionário

[Questionário] - Para dar sequência às atividades, responda as questões propostas.

Ampliando o conhecimento

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Semana 5

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