Kursthemen
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Coordenadores:
Prof. Dr. Wilson Araújo Silva
Profa. Dra. Aparecida Maria Fontes
Docentes Colaboradores:
Profa. Dra. Nilce Maria Martinês Rossi
Profa. Dra. Vanessa da Silva Silveira
Início da Disciplina: 18/02/2019
Término da Disciplina: 24/06/2019
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A proposta da disciplina RCB0300-Biotecnologia III é aplicar a metodologia de Aprendizado Baseado em Projetos – ABP (do inglês – Project-Based Learning-PBL) para o desenvolvimento de competências e habilidades em Biologia Molecular e Análise Genômica. Trata-se de uma abordagem de aprendizagem ativa que visa melhorar a qualidade do ensino de Genética, Genômica, Biologia Molecular e Celular, no curso de Ciências Biomédicas da FMRP/USP.
O conteúdo programático da disciplina foi organizado com 14 horas de aulas teóricas sobre os fundamentos de biologia molecular e de análise genômica aplicado ao estudo de microbiomas. Um quarto do tempo será destinado à aquisição de conceitos estruturantes (5 horas) sobre os métodos que serão usados no desenvolvimento das atividades. Estão previstas 44 horas (+/- 70% da carga horária do curso) para atividades laboratoriais, apresentação de artigo científico, estudo dirigido e pesquisa de campo (coleta das amostras).
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Local da aula: LMD 05
Professores: Wilson, Aparecida e Nilce
Apresentação da Disciplina
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Local da aula: LMD 05
Professor: Nilce Maria Martinês Rossi
Discutir sobre estrutura e função do genoma bacteriano. Definição e aplicação de Microbioma e Metagenômica. Sequenciamento Metagenômico vs. Sequenciamento convencional.
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20/02/2019 - Quarta-feira 8h a 10h. T03. Genomas procariotos, o locus ribossomal bacteriano e sua aplicação na análise de microbiomas
Local da aula: BD 1C
Professor: Aparecida Maria Fontes
Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:
- Conhecer a organização genética do genoma de um procarioto típico como o genoma de E. coli.
- Definir a estrutura dos ribossomos
- Compreender a estrutura de uma das classes de RNA produzidas por transcrição: RNA ribossomal
- Compreender a unidade de transcrição do rRNA
- Desenhar um par de "primers" (oligonucleotídeos "forward" e "reverse") para amplificação do locus ribossomal de 4 espécies de bactérias
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Local da aula: BD 1C
Professor: Wilson Araújo da Silva Jr
Apresentar os protocolos experimentais para o sequenciamento e análise de dados de genomas de eucariotos e procariotos.
Conceitos importantes: diferença entre os métodos de sequenciamento de Sanger e de NGS (Next Generation Sequencing) e suas aplicações; conhecer os diferentes protocolos experimentais de NGS para análise de transcriptomas, exoma, genoma completo, epigenoma, ...; ser capar de discussar sobre os parâmetros de qualidade do DNA e RNA, como pureza e integridade; saber o conceito e como calcular a cobertura de sequenciamento de NGS.
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Local da aula: BD 1C
Professor: Vanessa da Silva Silveira
A aula versará sobre a 1) Definição de biomarcadores; 2) Apresentação dos principais métodos de detecção; 3) Discussão sobre o uso como ferramenta auxiliar ao diagnóstico; 4) Potencial uso da análise do microbioma como biomarcador.
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Aula T05. Biomarcadores Datei
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Local de aula: BD 1C
Professor: Aparecida Maria Fontes
Objetivos: ao longo da abordagem deste tópico os alunos deverão ser capazes de:Determinar as temperaturas de "melting" e "annealing" dos primers forward e reverse para amplificação do locus 16S rRNA e os tamanhos dos amplicons de 5 procariotos selecionados;Conhecer e classificar os principais procariotos do grupo Bacteria de ambiente hospitalar. -
Local da aula: BD 1B
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
Prova sobre o conteúdo teório ministrado até o presente momento.
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27/02/19 - Quarta-feira - 10h a 12h - T08. Divisão dos Artigos Científicos e Discussão do desenho experimental do Projeto Microbioma
Local da aula: BD 1B
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
Discussão da logística de coleta das amostras, sequenciamento do microbioma e análise de bioinformática. Definição das áreas de coleta externas e internas do Hospital. Vídeo da coleta das amostras, e realizar um piloto da extração de DNA para analisar o microbioma.
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes e Wilson Araújo da Silva Júnior
Discussão de quentões que podem ser respondidas com o projeto Microbioma Hospitalar. Revisão do protocolo de extração de DNA e PCR da subunidade 16S rRNA. Realizar um piloto para treinamento de coleta e extração de DNA. A coleta será feita no Hemocentro, em 4 áreas de grande circulação de funcionários, alunos e de doadores. -
Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Quantificação do DNA extraído do material coletado em 4 áreas do Hemocentro.
2. Coleta das amostras nas áreas externas e internas do Hospital e extração de DNA das amostras de cada área coletada.
Piloto: Resultado da análise de qualidade, no Bioanalyzer, do PCR com primers para a subunidade 16S rRNA das amostras coletadas em 4 áreas de grande circulação do Hemocentro.
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Nilce Maria Martinês Rossi e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Avaliação da qualidade do DNA extraído nas áreas internas e externas do HC.
2. Discussão sobre o andamento do projeto até a fase de coleta.
3. Rediscutir as perguntas levantadas por cada grupo. Elas serão incluídas nos objetivos da proposta e do paper.
4. Planejar as próximas etapas do projeto após o recesso.
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Discussão dos resultados;
2. Apresentação do seminário do Grupo 1.
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Resumo do paper para seminário do Grupo 1
Background: In Norway, 91% of children aged 1–5 attend kindergarten where they are exposed to indoor microbiomes which can have relevance for development and health. In order to gain a better understanding of the composition of the indoor microbiome and how it is affected by occupancy over time, floor dust samples from a newly opened kindergarten were investigated. Samples were collected during an 11-month period. Samples were analyzed for bacterial composition using 16S rRNA gene sequencing. Samples were also screened for four clinically relevant antibiotic resistance genes. In addition, Petrifilm analyses were used to evaluate surface hygiene.
Results: Significant changes in the microbial community composition were observed over time (PERMANOVA, P< 0.05). Particularly, changes in the abundance and the proportions of human associated bacteria were found. A decrease in the prevalence of Propionibacterium from over 16% abundance to less than 1% and an increase in Streptococcus from 10 to 16% were the most significant findings. Four classes of clinically relevant antibiotic resistance genes were tested for; three were detected in the dust, indicating the presence of resistant bacteria and a potential for resistance spread. Petrifilm analysis showed that some surfaces in the kindergarten were of consistent poor hygienic quality, and new hygienic routines are required.
Conclusions: This study, which is the first of its kind performed at a newly opened kindergarten, reveals changes in the microbiome over time as well as the presence of antibiotic resistance genes and hygiene issues which are of relevance for occupant health.
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Apresentação do seminário do Grupo 2;
2. Análise da qualidade da biblioteca e do sequenciamento do microbioma (referência 16S rRNA) de cada ponto coletado fora e dentro do HC.
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Resumo do paper para o seminário do Grupo 2
The microorganisms that inhabit hospitals may influence patient recovery and outcome, although the complexity and diversity of these bacterial communities can confound our ability to focus on potential pathogens in isolation. To develop a community-level understanding of how microorganisms colonize and move through the hospital environment, we characterized the bacterial dynamics among hospital surfaces, patients, and staff over the course of 1 year as a new hospital became operational. The bacteria in patient rooms, particularly on bedrails, consistently resembled the skin microbiota of the patient occupying the room. Bacterial communities on patients and room surfaces became increasingly similar over the course of a patient’s stay. Temporal correlations in community structure demonstrated that patients initially acquired room-associated taxa that predated their stay but that their own microbial signatures began to influence the room community structure over time. The a- and b-diversity of patient skin samples were only weakly or nonsignificantly associated with clinical factors such as chemotherapy, antibiotic usage, and surgical recovery, and no factor except for ambulatory status affected microbial similarity between the microbiotas of a patient and their room. Metagenomic analyses revealed that genes conferring antimicrobial resistance were consistently more abundant on room surfaces than on the skin of the patients inhabiting those rooms. In addition, persistent unique genotypes of Staphylococcus and Propionibacteriumwere identified. Dynamic Bayesian network analysis suggested that hospital staff weremore likely to be a source of bacteria on the skin of patients than the reverse but that there were no universal patterns of transmission across patient rooms.
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Apresentação do seminário do grupo 3;2. Aula de noções de Linux e de bioinformática aplicada a análise de microbioma.
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Resumo do paper para o seminário do Grupo 3
Background: The neonatal intensive care unit (NICU) contains a unique cohort of patients with underdeveloped
immune systems and nascent microbiome communities. Patients often spend several months in the same room, and it has been previously shown that the gut microbiomes of these infants often resemble the microbes found in the NICU. Little is known, however, about the identity, persistence, and absolute abundance of NICU room-associated bacteria over long stretches of time. Here, we couple droplet digital PCR (ddPCR), 16S rRNA gene surveys, and recently published metagenomics data from infant gut samples to infer the extent to which the NICU microbiome is shaped by its room occupants.Results: Over 2832 swabs, wipes, and air samples were collected from 16 private-style NICU rooms housing very low birth weight (<1500 g), premature (<31 weeks’ gestation) infants. For each infant, room samples were collected daily, Monday through Friday, for 1 month. The first samples from the first infant and the last samples from the last infant were collected 383 days apart. Twenty-two NICU locations spanning room surfaces, hands, electronics, sink basins, and air were collected. Results point to an incredibly simple room community where 5–10 taxa, mostly skin-associated, account for over 50% of the amplicon reads. Biomass estimates reveal four to five orders of magnitude difference between the least to the most dense microbial communities, air, and sink basins, respectively. Biomass trends from bioaerosol samples and petri dish dust collectors suggest occupancy to be a main driver of suspended biological particles within the NICU. Using a machine learning algorithm to classify the origin of room samples, we show that each room has a unique microbial fingerprint. Several important taxa driving this model were dominant gut colonizers of infants housed within each room.
Conclusions: Despite regular cleaning of hospital surfaces, bacterial biomass was detectable at varying densities. A room-specific microbiome signature was detected, suggesting microbes seeding NICU surfaces are sourced from reservoirs within the room and that these reservoirs contain actively dividing cells. Collectively, the data suggests that hospitalized infants, in combination with their caregivers, shape the microbiome of NICU rooms.
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Apresentação do seminário do grupo 4;
2. Continuação da aula de bioinformática aplicada a análise de microbioma;
3. Discussão do resultado da análise de MH 16S rRNA.
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Resumo do paper para o seminário do Grupo 4
Background: Organisms causing healthcare associated infections can be sourced from the inanimate environment around patients. Residing in a biofilm increases the chances of these organisms persist-ing in the environment. We aimed to characterise bacterial environmental contamination, geneticallyand physiologically, and relate this to general intensive care unit (ICU) cleanliness.Methods: Cleanliness was determined by adenosine triphosphate (ATP) measurements of 95 high-touchobjects. Bacteriological samples were obtained from the same sites (n = 95) and from aseptically removedsections (destructive samples, n = 20). Bacterial enrichment culture was conducted using tryptone soyabroth prior to plating on horse blood agar, MacConkey agar, and screening chromogenic agar for identifi-cation of multidrug resistance organism (MDRO). Bacterial load and microbial diversity were determinedusing quantitative PCR (qPCR) and next generation DNA sequencing respectively. Confocal laser scanningmicroscopy and scanning electron microscopy were used to visually confirm the biofilm presence.Results: Many intensive care surfaces (61%) were highly contaminated by biological soil as determinedby ATP bioluminescence testing. The degree of biological soiling was not associated with bacterialcontamination as detected by qPCR. Bacterial load ranged from 78.21 to 3.71 × 108(median = 900) bac-teria/100 cm2. Surface swabs from 71/95 sites (75%) were culture-positive; of these 16 (22.5%) containedMDRO. The most abundant genera were Staphylococcus, Propionibacterium, Pseudomonas, Bacillus, Ente-rococcus, Streptococcus and Acinetobacter. Biofilm was visually confirmed by microscopy on 70% (14/20)of items.Conclusion: Bacterial biofilms and MDROs were found on ICU surfaces despite regular cleaning in SaudiArabia, suggesting that biofilm development is not controlled by current cleaning practices.
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Reorganizar os Grupos com troca de dois membros e distribuição das atividades para redação do artigo por grupo:
Grupo 1 (Introdução)
Grupo 2 (Material e Métodos)
Grupo 3 (Resultados)
Grupo 4 (Discussão e Abstract )
2. Tutoria sobre o andamento da redação. Cada docente (A, N, A e W) ficará com um grupo para avaliar, corrigir e orientar a redação do tópico de sua responsabilidade. (das 10 as 12)
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Tutoria sobre o andamento da redação. Cada docente ficará com um grupo para avaliar, corrigir e orientar a redação do tópico de sua responsabilidade.
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Local da aula: Hemocentro
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
1. Conclusão do artigo com apresentação dos resultados por cada grupo.
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Local da aula: BD 1C
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
- Teste de avaliação sobre o conteúdo das atividades prática.
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Local da aula: BD 1C
Professores: Aparecida Maria Fontes, Nilce Maria Martinês Rossi, Vanessa da Silva Silveira e Wilson Araújo da Silva Júnior
RECUPERAÇÃO